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Jul 29, 2023

Efecto antibacteriano sinérgico de las nanopartículas de cobre y plata y su mecanismo de acción

Informes científicos volumen 13,

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9202 (2023) Citar este artículo

Detalles de métricas

Las infecciones bacterianas son una de las principales causas de muerte en todo el mundo. En el caso de infecciones bacterianas tópicas como infecciones de heridas, la plata (Ag) ha sido históricamente uno de los antibacterianos más utilizados. Sin embargo, publicaciones científicas han demostrado los efectos adversos de la plata sobre las células humanas, la ecotoxicidad y el efecto antibacteriano insuficiente para la eliminación completa de las infecciones bacterianas. El uso de Ag en forma de nanopartículas (NPs, 1-100 nm) permite controlar la liberación de iones Ag antibacterianos pero aún no es suficiente para eliminar la infección y evitar la citotoxicidad. En este estudio, probamos la potencia de las NP de óxido de cobre (CuO) funcionalizadas de manera diferente para mejorar las propiedades antibacterianas de las NP de Ag. Se estudió el efecto antibacteriano de la mezcla de NP de CuO (CuO, CuO–NH2 y CuO–COOH) con NP de Ag (recubiertas y sin recubrir). Las combinaciones de CuO y Ag NP fueron más eficaces que Cu o Ag (NP) solas contra una amplia variedad de bacterias, incluidas cepas resistentes a los antibióticos, como Escherichia coli gramnegativa y Pseudomonas aeruginosa, así como Staphylococcus aureus grampositiva, Enterococcus faecalis y Streptococcus dysgalactiae. Mostramos que las NP de CuO cargadas positivamente mejoraron el efecto antibacteriano de las NP de Ag hasta 6 veces. En particular, en comparación con la sinergia de las NP de CuO y Ag, la sinergia de los iones metálicos respectivos fue baja, lo que sugiere que se requiere la superficie de la NP para mejorar el efecto antibacteriano. También estudiamos los mecanismos de sinergia y demostramos que la producción de iones Cu+, la disolución más rápida de Ag+ de las NP de Ag y la menor unión de Ag+ por las proteínas de los medios de incubación en presencia de Cu2+ fueron los principales mecanismos de la sinergia. En resumen, las combinaciones de CuO y Ag NP permitieron aumentar el efecto antibacteriano hasta 6 veces. Por lo tanto, el uso de combinaciones de CuO y Ag NP permite conservar excelentes efectos antibacterianos debido a Ag y la sinergia y mejora los efectos beneficiosos, ya que Cu es un microelemento vital para las células humanas. Por lo tanto, sugerimos usar combinaciones de Ag y CuO NP en materiales antibacterianos, como productos para el cuidado de heridas, para aumentar el efecto antibacteriano de Ag, mejorar la seguridad y prevenir y curar infecciones bacterianas tópicas.

El desarrollo de nuevos antibacterianos es una de las principales prioridades señaladas por la Organización Mundial de la Salud y la comunidad científica1. Un metanálisis reciente mostró que hubo 4,95 millones de muertes asociadas con la resistencia a los antibióticos en 2019 y destacó la necesidad de tomar medidas urgentes para abordar las infecciones bacterianas resistentes a los antibióticos2. La infección de la herida es un tipo de infección crónica que puede tener consecuencias graves, como la amputación de una extremidad y, si no se trata, la muerte. En el 15-27 % de los casos, la infección bacteriana de la herida provoca gangrena que requiere la amputación de la extremidad3, lo que demuestra que las estrategias actuales de tratamiento de la infección de la herida son ineficaces y se necesitan enfoques mejorados.

En el campo de los antibióticos tradicionales, el concepto sinérgico combinatorio se considera actualmente como uno de los enfoques más prometedores para tratar infecciones bacterianas y evitar la resistencia4. La combinación de diversos fármacos permite reducir la dosis de los fármacos y, por lo tanto, provoca menos efectos secundarios en comparación con la monoterapia5.

Sin embargo, los antibióticos se administran sistémicamente y sus combinaciones presentan perfiles farmacocinéticos impredecibles. Las combinaciones de NP aplicadas tópicamente evitarían estos inconvenientes de los antibióticos sistémicos. Por lo tanto, consideramos muy prometedora la aplicación de NP sinérgicos. Nuestra hipótesis es que, debido a los diferentes modos de acción sobre las bacterias, las NP de Cu y Ag tienen una mayor eficacia antibacteriana cuando se aplican juntas, mientras que el Cu mejora la eficacia antibacteriana de las NP de Ag, los mejores antibacterianos a base de metales conocidos hasta el momento. Además, el Cu es un microelemento y es beneficioso para la cicatrización de heridas, estimulando la migración de fibroblastos, favoreciendo la síntesis de colágeno, siendo esencial para la angiogénesis, apoyando la cicatrización de heridas6 y la regeneración ósea7. Por lo tanto, las combinaciones de Cu y Ag NP podrían tener un efecto antibacteriano superior, mejorar la cicatrización de heridas y, por lo tanto, ser un tratamiento altamente beneficioso para heridas infectadas.

Por separado, los efectos antibacterianos de las NP de CuO y Ag están bien estudiados. Usando las palabras clave "nanopartículas de plata* bacterias*" o "nanopartículas de cobre* bacterias*", la búsqueda en PubMed® realizada el 23 de marzo de 2023 recuperó 6558 y 1113 respuestas, respectivamente.

Los mecanismos antibacterianos de las NP de Ag per se son relativamente bien conocidos. Cuando entran en contacto con bacterias, las NP de Ag se localizan en la pared celular bacteriana y se oxidan, lo que lleva a la liberación concentrada de Ag en la interfase NP-célula8. Anteriormente mostramos que el daño a la pared celular de las bacterias gramnegativas por Ag NP ocurre principalmente en la membrana plasmática, mientras que la membrana externa de la célula bacteriana no era un objetivo de NPs9.

Los mecanismos moleculares de las NP de CuO están menos estudiados. En 2008, Heinlaan et al. demostraron que la toxicidad de las NP de CuO (CE50 = 79 mg/l) para la bacteria Vibrio fischeri pero también para los crustáceos se debía a los iones de Cu solubilizados10. En particular, a pesar de sus excelentes efectos antibacterianos, la toxicidad de CuO para las células humanas es menor en comparación con la toxicidad de Ag y Ag NP. Dado que el Cu es un microelemento vital, en algunos casos las NP de CuO facilitan efectos positivos como la mejora de la angiogénesis y la cicatrización de heridas6. Los mecanismos antibacterianos detallados de CuO NP se estudiaron más a fondo utilizando E. coli11 recombinante. En contraste con las NP de Ag que no causaron especies reactivas de oxígeno (ROS) en condiciones abióticas, las NP de CuO, especialmente las cargadas positivamente, indujeron niveles significativos de ROS. La carga superficial de las NP se puede modificar fácilmente mediante la funcionalización de la superficie y desempeña un papel en la inactivación de bacterias. Dado que la pared celular de las bacterias está cargada negativamente, las NP cargadas positivamente pueden adherirse mejor a las paredes celulares bacterianas e inactivar las bacterias de manera más eficiente.

Hemos estudiado las NP antibacterianas desde 2008 con el objetivo de comprender los mecanismos de toxicidad de las NP y aumentar su eficacia y seguridad1,8,9,10,12,13,14. Artículos recientes y nuestra investigación demostraron que el efecto antibacteriano de las NP se puede mejorar significativamente si las NP basadas en metales o los metales respectivos se usan en combinación. Sin embargo, casi todos los trabajos publicados anteriormente se centran en los efectos combinados de los iones metálicos y no en las NP15,16,17,18. Entre varias combinaciones de metales estudiadas (Ag con Cu, Zn, Co, Cd y Ni), la combinación de Ag y Cu tuvo el mayor efecto antibacteriano sinérgico contra bacterias Gram-negativas y Gram-positivas19. Existe un interés creciente en la sinergia entre Cu y Ag manifestado en más artículos publicados en los últimos años. La mayoría de ellos describieron las propiedades antibacterianas de las nanoaleaciones de Cu/Ag20,21 o Cu/Ag con la adición de algunos otros metales, por ejemplo, tungsteno22. Además, Jang y col. mostró propiedades antibacterianas perfectas antibiopelícula y cicatrización de heridas de los compuestos de Cu/Ag/óxido de grafeno en un modelo de ratón con herida infectada23. Sorprendentemente, a pesar de estos artículos que describen la sinergia antibacteriana entre Cu y Ag, no identificamos ninguna publicación que estudie sistemáticamente el estudio del efecto sinérgico de las combinaciones de NP o sus mecanismos.

En este estudio, planteamos la hipótesis de que el mecanismo antibacteriano sinérgico de las NP de CuO y Ag está impulsado por sus mecanismos de acción complementarios: las NP de Ag dañan las paredes celulares bacterianas, lo que facilita la entrada de las NP de CuO en las bacterias, donde las NP de CuO interrumpen las moléculas intracelulares. Más específicamente, primero describimos el efecto antibacteriano sinérgico entre Ag y CuO NP con diferentes grupos funcionales contra varias bacterias, incluidas las bacterias multirresistentes. En segundo lugar, realizamos una serie de pruebas para comprender los mecanismos de la sinergia antibacteriana de las NP: medimos el daño de la membrana externa, la inducción de ROS, la biodisponibilidad de los iones Cu y Ag y la transformación de carga del ion Cu.

La caracterización de las NP utilizadas en este estudio se muestra en la Tabla 1. Las NP de CuO (CuO) y CuO funcionalizadas con grupos amino (CuO–NH2) tenían un potencial zeta positivo, las CuO funcionalizadas con grupos carboxilo (CuO–COOH) tenían un potencial zeta negativo. potencial. Todas las NP de Ag analizadas tenían un fuerte potencial zeta negativo que oscilaba entre -56,6 mV en el caso de las nanopartículas de plata recubiertas (cAg) y -27,7 mV en el caso de la nanoplata (nAg). En el medio de cultivo celular RPMI (RPMI CCM), el potencial zeta de las NP fue negativo para todas las NP, desde − 8,9 mV (CuO–NH2) hasta − 10,8 mV (CuO), muy probablemente debido a la adsorción de las proteínas séricas. (llamado "corona de proteínas", un camuflaje dinámico que resulta de la adherencia de proteínas en la superficie de las NP) como lo sugirieron previamente Ivask et al.24. Por lo tanto, asumimos que la adsorción de proteínas enmascaró al menos parcialmente el efecto de las cargas de NP en todos los experimentos posteriores. La disolución entre Ag NPs fue la más alta en el caso de Ag2O y la más baja en el caso de nAg.

El efecto sinérgico se caracterizó por primera vez utilizando el medio de prueba de cultivo celular RPMI porque contiene suero sanguíneo con factores de crecimiento, lo que lo hace similar al trasudado que aparece durante la infección del tejido. En la figura 1 se muestra un ejemplo del efecto antibacteriano sinérgico de las NP. Para demostrar el efecto sinérgico, utilizamos la concentración bactericida mínima (MBC, la concentración más baja probada que no produce crecimiento bacteriano visible en medio de crecimiento agarizado) como proxy. Mientras que se requerían 40 mg/l de NP de Ag o 400 mg/l de NP de CuO para inactivar irreversiblemente E. coli, solo se necesitaban 5 mg/l de NP de Ag + 25 mg/l de NP de CuO cuando se usaban en combinación (Fig. 1).

La sinergia antibacteriana entre CuSO4 y cAg. La suspensión de Escherichia coli K-12 se incubó con diferentes concentraciones de Ag NP, CuSO4 o sus combinaciones en medio de cultivo celular RPMI durante 24 h. Después de la incubación, se pipetearon 3 μl de la mezcla de bacterias y NP en caldo agarizado y se determinó la concentración bactericida mínima (MBC, la concentración más baja probada que no produce crecimiento bacteriano visible después de 24 h de incubación a 37 °C en la oscuridad). Las concentraciones de cAg y CuSO4 se muestran en los ejes. La concentración mínima bactericida de CuSO4 y cAg fue de 400 mg/L y 40 mg/L respectivamente.

Para cuantificar y comparar el efecto sinérgico entre diferentes NP y entre varias cepas bacterianas, introdujimos el término "coeficiente de sinergia antibacteriana", K(AbS), que muestra la eficiencia antibacteriana de las combinaciones de NP (mezcla) en comparación con la suma de los valores de MBC de NP individuales y calculado de la siguiente manera (Ec. 1):

La ecuación (1) muestra el cálculo del coeficiente de sinergia antibacteriana (K(AbS) a partir de concentraciones bactericidas mínimas (MBC).

Vaidya et al.16 informaron previamente cálculos de sinergia similares para mezclas de metales. K(AbS) > 1 marca sinergia, K(AbS) = 1 marca efecto aditivo o K(AbS) < 1 marca antagonismo.

La Figura 1 demuestra que el MBC de la mezcla de cAg y CuO NP es varias veces menor que el MBC de los componentes por separado. Según la fórmula de \({\text{K}}\left( {{\text{AbS}}} \right) = 1/\left( {\frac{{50\;{\text{mg}}/ {\text{L}}}}{{400\;{\text{mg}}/{\text{L}}}} + \frac{{2.5\;{\text{mg}}/{\text {L}}}}{{40\;{\text{mg}}/{\text{L}}}}} \right)\) = 1/(1/8 + 1/16) = 5,33. Así, en este ejemplo, el efecto antibacteriano de la mezcla fue 5,33 veces mayor que la suma de los efectos antibacterianos de los componentes por separado.

Los cálculos para la mezcla de 25 mg/L de CuSO4 + 5 mg/L de cAg dan como resultado el mismo K(AbS). Sin embargo, K(AbS) es menor en otras variaciones de las relaciones CuSO4/cAg (por ejemplo, 200 mg/L de CuSO4 + 1,5 mg/L de mezcla de cAg). La diferencia entre K(AbS) dependiendo de la relación Cu/Ag se muestra en la Fig. 1 complementaria. La K(AbS) más alta se observó principalmente usando la relación de 1:1 a 12,5:1 Cu/Ag.

Los valores de MBC de diferentes componentes de Cu solos y en la mezcla con cAg en diferentes bacterias se muestran en la Tabla complementaria 1. Los valores de MBC para diferentes bacterias fueron similares, excluyendo P. aeruginosa, que era resistente a los compuestos de Cu, a pesar de que cAg MBC para P. aeruginosa fue similar. similar a la de otras bacterias.

El K (AbS) calculado para diferentes bacterias se muestra en la Fig. 2. Se encontró el evidente efecto sinérgico antibacteriano entre la mayoría de los compuestos de Cu y las NP de Ag (Fig. 2, Tabla complementaria 1).

Coeficiente de sinergia antibacteriana entre cAg y componentes de cobre en diferentes bacterias en el medio de cultivo celular RPMI. Se muestran los valores medios con la desviación estándar. *P < 0,05; **P < 0,01; *** P < 0,001. cAg, nanopartículas de plata recubiertas; CuO Óxido de cobre; CuO–NH2, óxido de cobre recubierto con grupos amino; CuO–COOH, Óxido de cobre recubierto con grupos carboxilo; CuSO4, sulfato de cobre.

Entre las NP de CuO, la mayor K(AbS) con cAg se observó con CuO no funcionalizado y especialmente con CuO–NH2, ambos con carga positiva. La K(AbS) más baja se observó con CuO-COOH con carga negativa, siendo en su mayoría inferior a 2. Esto sugiere que la carga prístina de las NP de CuO (reflejada en el potencial zeta en el agua MQ) afectó la sinergia antibacteriana. Curiosamente, la carga de NP fue uniforme en el medio de cultivo celular debido a la proteína corona (Tabla 1). Esto sugiere que algunas superficies prístinas de NP permanecieron disponibles incluso después de la formación de la corona de proteínas en el medio de cultivo celular.

La K(AbS) más alta se observó para E. faecalis y E. coli (tanto K-12 como ESBL). Es interesante notar que E. coli ESBL es más resistente a los antibióticos en comparación con E. coli K12 y también fue más resistente a cAg en este estudio. Sin embargo, los valores de K(AbS) fueron similares en el caso de estas bacterias. Para E. faecalis, se observó K(AbS) alto para todas las combinaciones que pueden ser el resultado de una tasa más rápida de destrucción del ADN por parte de los componentes de Cu en comparación con las enterobacterias (como E. coli)25.

P. aeruginosa tuvo la K(AbS) más baja de todas las bacterias analizadas. La razón de esto podría ser el poderoso sistema de eflujo antidrogas y la disminución de la permeabilidad de la membrana externa26.

Realizamos estudios adicionales con varios Ag NP y AgNO3 para determinar cuál de ellos tendría una sinergia antibacteriana más fuerte con los componentes de Cu.

La Tabla complementaria 2 muestra los hallazgos de MBC en E. coli K-12 con varios componentes de Ag y Cu en la mezcla y solos. Los K(AbS) calculados se muestran en la Fig. 3.

Coeficiente de sinergia antibacteriana (K(AbS)) entre diferentes componentes Ag y Cu en medios de cultivo celular RPMI con la cepa Escherichia coli K-12. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001, ##P < 0,01 antagonismo. Tenga en cuenta que K(AbS) se calculó como K(AbS) medio a partir de diferentes experimentos, no a partir del MBC medio de los componentes en la mezcla o solos. Se muestran los valores medios con la desviación estándar. cAg, nanopartículas de plata recubiertas; nAg, nanoplata; Ag2O, Óxido de plata; AgNO3, nitrato de plata; CuO, óxido de cobre; CuO–NH2, óxido de cobre recubierto con grupos amino; CuO–COOH, Óxido de cobre recubierto con grupos carboxilo; CuSO4, sulfato de cobre.

Cuando se mezclaron con componentes de Cu, la mayoría de las NP de Ag mostraron una alta K(AbS). Por el contrario, AgNO3 no demostró una fuerte sinergia antibacteriana con los componentes de Cu (Fig. 3, Tabla complementaria 2). Los K(AbS) más altos se observaron para tres mezclas: cAg con CuSO4 y nAg con CuSO4/CuO–NH2. El hecho de que CuSO4 y CuO–NH2 estuvieran bien disueltos (Tabla 1) y, por lo tanto, fueran una fuente de iones Cu, sugiere que los iones Cu son necesarios para la sinergia. El resultado atípico de K(AbS) fue en la mezcla de Ag2O y CuSO4 (sin sinergia). En contraste con cAg y nAg, las NP de Ag2O estaban más oxidadas (disueltas). Estos datos indican claramente que se requieren iones Cu y NP de Ag no oxidados para lograr el fuerte efecto sinérgico antibacteriano.

A continuación, estudiamos si el medio de cultivo tenía efecto sobre la sinergia antibacteriana. El MBC de cAg, CuSO4 y sus mezclas en diferentes medios se muestra en la Tabla complementaria 3, y K (AbS) en la Fig. 4. En medio de crecimiento bacteriano con alto contenido de proteínas y nutrientes, K (AbS) fue mayor. El K(AbS) más alto estaba en medio LB y el más bajo estaba en MQ (Fig. 4). Es importante destacar que el crecimiento de bacterias también fue más rápido en LB (Fig. 2 complementaria). Esto sugiere que la sinergia es más prominente para las células en la fase activa y en división. Lo más probable es que, en condiciones de crecimiento bacteriano activo, las NP y los iones metálicos liberados de las NP tengan un mejor acceso al espacio intracelular para destruir el ADN27 y dañar las proteínas. Curiosamente, también los antibióticos tradicionales inactivan las bacterias con menos eficacia en la fase de no crecimiento, especialmente S. aureus28.

Coeficiente de sinergia antibacteriana en diferentes medios. Coeficiente de sinergia antibacteriana en la mezcla de nanopartículas de plata recubiertas y sulfato de cobre en diferentes medios de crecimiento frente a la cepa K-12 de Escherichia coli. Se muestran los valores medios con desviaciones estándar. Agua MQ MilliQ, RPMI.

Se realizaron varias pruebas adicionales para comprender los mecanismos de sinergia antibacteriana entre Cu y Ag. Se planteó la hipótesis de que la sinergia antibacteriana es una función de los diferentes modos de acción de Cu y Ag. La interacción de los antibióticos betalactámicos, que dañan la membrana celular de las bacterias, y los aminoglucósidos, que inhiben la síntesis de proteínas en las bacterias, es un ejemplo bien conocido de la sinergia clásica de los antibióticos. La sinergia entre los aminoglucósidos y los β-lactámicos se ha atribuido al daño de la membrana mediado por los β-lactámicos que conduce a una mayor captación de aminoglucósidos29.

Una hipótesis era que uno de los componentes (Cu o Ag NP) daña la membrana en mayor medida, lo que permite que otro componente penetre en la célula con mayor facilidad y dañe las estructuras internas. La polimixina B, que altera las membranas bacterianas externas de las células gramnegativas30, se utilizó como control positivo en este experimento. Para verificar la hipótesis, se midió la permeabilidad de la membrana externa de dos bacterias Gram negativas, E. coli K-12 y Pseudomonas aeruginosa PAO1. Los resultados mostraron que AgNO3 y cAg dañaron la membrana externa de ambas bacterias (Figs. 5a,b). cAg requirió más tiempo para dañar la membrana en comparación con AgNO3, y la membrana de P. aeruginosa requirió más tiempo para dañarse en comparación con E. coli. CuO NPs y CuSO4 no causaron un daño notable en la membrana, especialmente en P. aeruginosa. Estos datos sugieren que una de las formas de inactivar las células en el caso de los compuestos de Ag es destruyendo las membranas externas de las bacterias, mientras que los compuestos de Cu actúan sobre otras estructuras celulares (incluso altas concentraciones de Cu que conducen a la muerte celular en 24 h no lo hacen). no conducir a una rápida destrucción de la membrana externa). La destrucción de la membrana por Ag podría ayudar a Cu a alcanzar estas estructuras celulares internas en el caso de la mezcla de Ag y Cu. Basándonos en estos datos, decidimos probar esta hipótesis mezclando compuestos de Cu y Ag. También se realizó una prueba con una mezcla de compuestos de Cu y cAg. La acción dañina de cAg en la membrana no se vio afectada por la adición de CuSO4 o Cu-NH2 (Fig. 5c, d). También se realizaron pruebas con la adición de CuO-COOH o CuO a cAg, y no se detectó el efecto destructivo adicional sobre la membrana (no se muestra), así como con la adición de CuSO4 o Cu-NH2. Además, la adición de componentes de Cu a la polimixina B, que daña rápidamente la membrana externa, no mejoró el efecto de la polimixina B en la membrana (datos no mostrados). Además, no se ha detectado el efecto sinérgico antibacteriano entre CuSO4 y polimixina B en E. coli K-12 en la prueba MBC (K(AbS) = 1,054 ± 0,243, datos no mostrados). Por lo tanto, concluimos que Ag y Cu actúan de manera diferente sobre la membrana externa bacteriana, pero su acción sobre la membrana externa no es la causa principal de la sinergia antibacteriana.

Daño de la membrana bacteriana externa por compuestos de Ag y Cu o su combinación. El aumento de la fluorescencia indica el daño de la membrana externa de Escherichia coli (a, c) y Pseudomonas aeruginosa (b, d) después de 30 min de incubación con los componentes solos (a, b) y en las mezclas con cAg (c, d) . Se muestran los valores medios con la desviación estándar. cAg, nanopartículas de plata recubiertas; AgNO3, nitrato de plata; CuO, óxido de cobre; CuO–NH2, óxido de cobre recubierto con grupos amino; CuO–COOH, Óxido de cobre recubierto con grupos carboxilo; CuSO4, sulfato de cobre; PB, Polimixina B.

La posibilidad de que los iones Cu realicen un ciclo redox entre Cu+/Cu++ se conoce como una reacción tipo Fenton, y puede generar especies reactivas de oxígeno (ROS) que conducen a la peroxidación de lípidos, la oxidación de proteínas y el daño del ADN31. A continuación, planteamos la hipótesis de que la producción mejorada de ROS podría ser la razón de la sinergia entre los componentes Cu y Ag. De hecho, se demostró previamente que CuO NPs13 y Ag NPs32 inducen ROS. También demostramos previamente que CuO–NH2 induce más ROS en comparación con CuO y CuO–COOH13 no funcionalizados.

La generación de ROS en este estudio se determinó tanto en condiciones bióticas (en presencia de bacterias) como abióticas (sin bacterias) (Fig. 6). Los niveles más altos de ROS se detectaron en suspensiones individuales de cAg y CuO-NH2 (Fig. 6a, b). cAg indujo los niveles más altos de ROS en condiciones abióticas (Fig. 6a), mientras que CuO–NH2 en condiciones bióticas (Fig. 6b). No se detectaron ROS en el caso de CuSO4 y AgNO3.

Producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) en suspensiones. Medición de la inducción de ROS en condiciones abióticas (a, c) y bióticas (b, d). La medición de la inducción de ROS se realizó después de la incubación con los componentes solos (a, b) o en la mezcla de los componentes cAg y Cu en una proporción de 1:4 (c, d). cAg, nanopartículas de plata recubiertas; AgNO3, nitrato de plata; CuO, óxido de cobre; CuO–NH2, óxido de cobre recubierto con grupos amino; CuSO4, sulfato de cobre; RFU, Unidades relativas de fluorescencia.

Se probaron ROS en la mezcla de cAg y Cu (en una proporción de 1:4) para controlar la hipótesis de que el cAg producirá más ROS después de la adición de CuSO4 o CuO–NH2. Los resultados mostraron que la adición de CuO-NH2 o CuSO4 a cAg no mejoró la producción de ROS en condiciones bióticas y abióticas (Fig. 6c, d). Además, se ha detectado antagonismo (por ejemplo, menor ROS en la mezcla de componentes cAg + Cu en comparación con cAg solo), lo que indica que ROS no fue la causa de la sinergia antibacteriana.

Dado que la toxicidad de las NP de base metálica se debe principalmente a sus iones10,33, decidimos medir los iones de Cu y Ag intracelulares. Para ello, utilizamos el biosensor bioluminiscente E. coli MC1061 pSLcueR/PDNPcopAlux, que produce luciferasa en respuesta a Cu y Ag34 intracelulares. En esta bacteria, los iones de Ag y Cu intracelulares inducen la luminiscencia de las bacterias de forma dependiente de la dosis.

Dado que las bacterias biosensoras no son selectivas y detectan tanto los iones Ag como los Cu, no fue posible determinar la Ag y el Cu intracelulares individualmente. Por lo tanto, usamos los valores relativos y el coeficiente de sinergia inductiva K(InS). K(InS) se calculó de la misma manera que el coeficiente de sinergia antibacteriana. K(InS) es el recíproco de la suma de las proporciones de las concentraciones máximas de bioluminiscencia (LC) de los componentes en la mezcla a las concentraciones máximas de LC solas (ecuación 2).

La ecuación (2) muestra el cálculo del coeficiente de sinergia inductiva (K(InS)) a partir de concentraciones máximas de bioluminiscencia (LC) (conc).

Al principio, se midió la bioluminiscencia de bacterias con componentes individuales de Ag y Cu (Fig. 7a). Posteriormente, mezclamos componentes de Cu con cAg y encontramos un cambio significativo en el pico de LC hacia la izquierda (Fig. 7b), pero ningún cambio al mezclar con AgNO3 (Fig. 7c). Las concentraciones máximas de LC de los componentes por separado y en la mezcla se muestran en la Tabla complementaria 4.

Luminiscencia de bacterias biosensoras como reacción a componentes. Luminiscencia (LC) de Escherichia coli MC1061 pSLcueR/PDNPcopAlux como reacción a 4 h de incubación con componentes solos (a). El cambio significativo del pico LC hacia la izquierda en la mezcla de componentes de cobre con cAg en comparación con cAg solo (b). Sin cambio de pico de LC en la mezcla de componentes de cobre con AgNO3 en comparación con AgNO3 solo (c). Las cifras representativas son de 3 experimentos independientes. cAg, nanopartículas de plata recubiertas; AgNO3, nitrato de plata; CuO, óxido de cobre; CuO–NH2, óxido de cobre recubierto con grupos amino; CuO–COOH, Óxido de cobre recubierto con grupos carboxilo; CuSO4, sulfato de cobre.

La alta inducción de bioluminiscencia en respuesta a la concentración intracelular de iones Cu y Ag se observó en las mezclas de componentes Cu con cAg (Fig. 7b). Se requirieron concentraciones más bajas de componentes cAg y Cu en las mezclas para la inducción de la respuesta. En combinación de componentes de Cu con cAg, todas las mezclas ensayadas mostraron una alta K(InS), pero no en las mezclas de componentes de Cu y AgNO3 (Fig. 8). El hecho de que K(InS) fuera notablemente superior a 1 en el caso de las mezclas de componentes cAg y Cu reveló que las bacterias biosensoras detectaron concentraciones intracelulares más altas de iones metálicos en la mezcla de componentes cAg y Cu en comparación con la suma de los componentes por separado. Esto no se atribuyó al daño de la membrana causado por cAg y un mejor acceso de Cu a los componentes internos de las células (Fig. 5c, d). Se puede suponer que la concentración intracelular de Ag, cuando se combina con CuSO4, fue mayor debido a una mejor disolución de cAg en presencia de Cu2+. Además, la disolución de AgNO3 es muy alta y no puede ser potenciada por iones Cu, por lo que no observamos el efecto sinérgico entre los componentes Cu y AgNO3.

Coeficiente de sinergia inductiva en una mezcla de componentes Cu y Ag. La inducción de bioluminiscencia en bacterias fue mayor en respuesta a la mezcla de componentes cAg y Cu en comparación con los componentes solos. Esta reacción mejorada no se ha detectado en la mezcla de NP de AgNO3 y CuO. *P < 0,05; **P < 0,01; ***P < 0,001, ##antagonismo P < 0,01. cAg, nanopartículas de plata recubiertas; AgNO3, nitrato de plata; CuO, óxido de cobre; CuO–NH2, óxido de cobre recubierto con grupos amino; CuO–COOH, Óxido de cobre recubierto con grupos carboxilo; CuSO4, sulfato de cobre.

A continuación, investigamos la disolución de Ag NP en agua y RPMI CCM en dos condiciones diferentes: con y sin la adición de CuSO4. Encontramos una diferencia significativa entre la disolución de Ag NP con y sin adición de CuSO4 (Fig. 9). En agua MQ, la diferencia de disolución de nAg y Ag2O fue más de 4 veces y 2 veces respectivamente después de la adición de CuSO4. Mientras que en RPMI CCM la diferencia de disolución de nAg fue más de 16 veces después de la adición de CuSO4 (Fig. 9). Suponemos que en la mezcla de nAg y CuSO4 en el agua existe el efecto de mejorar la disolución de las NP de Ag por la siguiente Ec. 3:

Disolución de nanopartículas de plata. Porcentaje de disolución de componentes de plata (100 mg/L) en agua y en RPMI CCM con y sin adición de CuSO4 (400 mg/L) tras 24 h de incubación en agitador a 37 °C. *P < 0,05; **P < 0,01; *** P < 0,001. cAg, nanopartículas de plata recubiertas; nAg, nanoplata; Ag2O, Óxido de plata; AgNO3, nitrato de plata; CuSO4, sulfato de cobre; RPMI CCM, medios de cultivo celular del Roswell Park Memorial Institute.

La ecuación (3) muestra la reacción redox entre los componentes de cobre y plata.

En RPMI, lo más probable es que la reacción esté influenciada por compuestos orgánicos. Por ejemplo, la disolución de AgNO3 en RPMI CCM que contiene suero puede ser del 100 %, pero la mayoría de los iones Ag+ libres forman complejos con proteínas séricas35. Debido a que los iones Cu evitan que los iones Ag se unan a las proteínas séricas, hubo una diferencia significativa en la concentración de iones Ag libres en una solución de AgNO3 en RPMI CCM con y sin CuSO4. Ambos efectos están presentes en una suspensión de nAg y CuSO4 en RPMI CCM, lo que da como resultado un aumento de 16 veces en la cantidad de iones Ag libres en una muestra que contiene CuSO4 en comparación con una muestra sin CuSO4 (Fig. 9). Además, como se describió anteriormente, el Ag2O ya oxidado no tuvo sinergia antibacteriana en RPMI CCM con CuSO4 y no observamos una mejor disolución de Ag2O en este solvente después de la adición de CuSO4 (Fig. 9).

Como se mencionó en la sección anterior (Ec. 3), Cu+ se produce en la mezcla de Ag NPs e iones Cu2+. Para probar la presencia de Cu+ en la mezcla, se realizó una reacción química cualitativa como se describe en la sección de Métodos. En una mezcla de componentes, la reacción cualitativa demostró la presencia de Cu+, pero no en la suspensión de nAg, ni en las soluciones de AgNO3 o CuSO4 por separado. Esta investigación demostró que el equilibrio se estableció como se esperaba. Además, se ha demostrado previamente que el Cu+ tiene un mayor efecto antibacteriano en comparación con el Cu2+36,37, debido a la capacidad del Cu+ para generar radicales OH en presencia de superóxido en una reacción análoga a la reacción tipo Fenton38. Por lo tanto, la formación de iones Cu+ adicionales en la solución puede estar entre los principales factores que afectan la sinergia antibacteriana del sistema Ag NP/Cu2+.

Comúnmente, la sinergia ocurre cuando los componentes tienen diferentes mecanismos de acción. Aunque la sinergia antibacteriana entre los componentes Ag y Cu (principalmente metales y no NP) se ha descrito antes, los mecanismos de sinergia no se han estudiado. Publicaciones anteriores sugirieron algunos mecanismos de sinergia antibacteriana, mientras que los autores plantearon principalmente la hipótesis de que el Ag se dirige a la membrana plasmática bacteriana, mientras que el Cu desnaturaliza los ácidos nucleicos y otras biomoléculas internas y estructuras celulares15,16,19,22. Por el contrario, en nuestro estudio, no observamos una sinergia notable entre los componentes de Cu y AgNO3 (Fig. 2) o Polimixina B, que causaron un daño notable en la membrana (Fig. 5).

Además, se ha propuesto que los iones de Cu liberados de las aleaciones de CuO inactivan las bacterias al aumentar la producción de ROS, lo que provoca daño en el ADN y peroxidación de lípidos16,19,22. Además, las NP de Ag ancladas en CuO y Cu(OH)2 produjeron ROS en cantidades mayores en comparación con CuO39, pero en este caso, la producción de ROS podría mejorar debido a Cu(OH)2. Sin embargo, no observamos una producción significativa de ROS en solución de CuSO4 en condiciones bióticas o abióticas, mientras que la producción de ROS por cAg fue notablemente mayor. Por el contrario, la adición de CuSO4 redujo la cantidad de producción de ROS en suspensión de cAg en condiciones bióticas y abióticas (Fig. 6).

Jang y otros. (2020) demostraron que la liberación de iones Ag+ de NP fue significativamente mayor en la solución con mayor concentración de iones Cu2+23. Además, la mayor liberación de Ag+ se relacionó con la mayor temperatura y el mayor tiempo de incubación de las NP21. Este mecanismo de sinergia está en línea con los resultados de nuestro estudio.

Nuestra investigación ha demostrado que una combinación de NP de Ag no oxidados e iones de Cu es esencial para el efecto antibacteriano sinérgico. La sinergia antibacteriana entre las NP de Ag y los componentes de Cu, según nuestro estudio, tiene al menos tres razones. Primero, los iones Cu facilitan la oxidación de Ag0 no oxidado (Ec. 3) en una reacción redox y, como resultado, una mejor disolución de Ag+ de Ag NP en solventes en presencia de Cu2+ (Fig. 9). De hecho, se necesita Ag0 no oxidado en las NP para la reacción redox con Cu2+ para producir Ag+ y Cu+. Una mejor disolución de las NP de Ag conduce a una mayor concentración de Ag+ en el solvente e intracelularmente en las bacterias (Fig. 7), lo que provoca un efecto antibacteriano más fuerte. La segunda razón es la producción de iones Cu+ en la misma reacción redox (Ec. 3). Los iones Cu+ son más antibacterianos en comparación con los Cu2+38. La tercera razón es que los iones de Ag libres se unen a las proteínas en el medio de cultivo con menos eficacia en presencia de Cu2+, lo que da como resultado una mayor concentración de Ag+ libre en la solución (Fig. 9). Por lo tanto, se requiere la liberación de iones Cu2+ de CuO NPs para la acción sinérgica. Todos los procesos descritos pueden ocurrir tanto a nivel extracelular como intracelular, siendo este último más perjudicial para la homeostasis celular. Además, otros factores, como el potencial zeta y la funcionalización de la superficie NP, podrían tener algunos efectos menores en la sinergia antibacteriana, pero para demostrarlo, se requieren más estudios.

Ag y Cu se han utilizado por separado como agentes antibacterianos desde la antigüedad. Nuestro estudio mostró que el efecto antibacteriano de la mezcla de NP que contenía los componentes Ag y Cu fue hasta seis veces mayor que la suma de los efectos antibacterianos de los componentes individuales. Los mecanismos de la sinergia son: una mejor disolución de Ag en presencia de iones Cu debido a la oxidación en la reacción redox, la producción de más iones Cu+ antibacterianos durante la misma reacción redox y una unión menos favorable de los iones Ag a las proteínas del medio en presencia de de iones Cu. La sinergia antibacteriana entre Ag y Cu podría ser una solución ideal para algunos problemas médicos donde se necesita la eliminación de infecciones y donde el efecto antibacteriano de Ag o Cu por sí solo no es suficiente. Por ejemplo, los resultados del estudio se pueden usar para desarrollar nanotecnología combinatoria para usar en apósitos antibacterianos para heridas para tratar heridas infectadas. Dado que el tratamiento de algunas infecciones bacterianas de heridas es un problema sin resolver, el tratamiento combinado de heridas basado en Cu y Ag NP podría reducir las complicaciones de la infección de heridas (como gangrenas y amputaciones relacionadas con infecciones) y aumentar los años de vida ajustados por calidad (QALY) de pacientes

Todos los productos químicos eran al menos de grado analítico. La polimixina B y el NaCl se adquirieron de Sigma-Aldrich Co. (EE. UU.); AgNO3 de JT Baker (EE. UU.), CuSO4 de Alfa Aesar Gmbh & Co. (Alemania); diacetato de 2',7'-diclorodihidrofluoresceína de Life Technologies (EE.UU.); solución salina tamponada con fosfato de Biognost (Croacia); triptona, extracto de levadura y agar de LabM (UK); RPMI 1640 con glutamina y piruvato de sodio de Corning (EE. UU.); Suero fetal bovino de Gibco (EE.UU.).

Se obtuvieron tres tipos de CuO NP funcionalizados y no funcionalizados de PlasmaChem GmbH (Alemania). PlasmaChem sintetizó CuO NP mediante la descomposición de Cu2CO3(OH)2, seguida de la introducción de los grupos superficiales mediante el tratamiento con ácido mercaptopropiónico. Las NP de Ag recubiertas (cAg) se obtuvieron de Laboratorios Argenol SL (España), las NP de Ag sin recubrir (nAg) de Sigma-Aldrich (EE. UU.). Las NP de Ag2O (Ag2O) fueron sintetizadas por nosotros como se describe a continuación.

Las NP comerciales se proporcionaron como polvos secos y las suspensiones se prepararon recién preparadas cada vez antes de las pruebas a concentraciones de 2000 mg de compuesto/l en agua Milli-Q® libre de endotoxinas (MQ). Diez mililitros de suspensiones de NP de CuO se sometieron a agitación vorticial y sonicación mediante sonicación con sonda (Branson 450 Sonifier, EE. UU.) durante 5 min con una potencia acústica de 13 W correspondiente a la energía específica de 3,9 · 105 kJ/m340.

La morfología y el tamaño primario de todas las NP excepto Ag2O se caracterizaron en nuestros estudios previos8,13,41.

La caracterización de Ag2O NP por cristalografía de rayos X y microscopía electrónica de transmisión se realizó en la Universidad de Tartu. Las mediciones de microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) se realizaron con el instrumento FEI Titan Themis 200 con corrección de Cs. Las muestras se prepararon en alcohol isopropílico, se sometieron a ultrasonidos y se depositaron en rejillas TEM cubiertas con película de carbono. Después de la evaporación del solvente, las muestras se midieron con detectores de campo claro (BF) y de campo oscuro anular de ángulo alto (HAADF) simultáneamente.

El tamaño hidrodinámico (Dh), el índice de polidispersión (PDI) y el potencial zeta (Zeta-potencial) de las NP se midieron en suspensiones de 100 mg/l en agua MQ o en medio de cultivo celular Roswell Park Memorial Institute (RPMI) con 10% de FBS y 1 % de piruvato de sodio (RPMI CCM) utilizando Malvern Zetasizer (Zetasizer Nano-ZS, Malvern Instruments, Reino Unido).

El contenido de metal de los compuestos probados se determinó mediante espectroscopía de absorción atómica (AAS) (contrAA 800, Analytik Jena Ag). Los materiales y las nanopartículas se incubaron en 1 ml de HNO3 concentrado (Nitric Acid TraceMetal Grade 67–69 %, Seastar Chemicals) durante 24 h a 65 ºC. Después de la incubación, la suspensión se agitó y diluyó 1:1000 en HNO3 al 1 %. El tejido y el suero sanguíneo se incubaron en H2O2 (Perdrogen 30 %, Sigma-Aldrich) y HNO3 concentrado en la siguiente proporción 1:1:8 (tejido: H2O2: HNO3) y se incubaron durante 24 h a 65ºC. Después de la incubación, el La suspensión se diluyó 10 veces en HNO3 al 1% y se analizó por AAS. Las mediciones se realizaron por triplicado en al menos dos experimentos independientes.

Se disolvió nitrato de plata de grado reactivo analítico (anhidro, con una pureza superior al 99,9 %) (5 mmol, 0,85 g) en 50 ml de agua DI y se ultrasonicó durante 1 min para lograr una solución homogénea a temperatura ambiente.

Después de que el nitrato de plata se disolvió totalmente, se añadió rápidamente hidróxido de sodio (10 mmol, 0,39 g) a la mezcla de reacción en condiciones ambientales y se ultrasonicó durante 2 h.

La solución final se enfrió. Luego, el precipitado negruzco obtenido se filtró en papel de filtro Whatman (Grado 5) y se inactivó dos veces con 50 ml de agua MQ. Luego, el residuo negro se secó a 70 °C durante 12 h, proporcionando rendimientos superiores al 60 %.

Escherichia coli MG1655 K-12 (E.coli K-12) (obtenido del centro de stock genético de E. coli, Universidad de Yale), Escherichia coli ESBL (aislado de la orina de un paciente masculino de 72 años con prostatitis crónica en West-Tallinn Central Hospital), Pseudomonas aeruginosa PAO1 (obtenida del Prof. Patrick Plesiat, Besanc, Francia), Streptococcus dysgalactiae DSM 23,147 (obtenida de la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares del Instituto Leibniz, Braunschweig, Alemania), E. coli bioluminiscente recombinante MC1061 (pSLcueR /pDNPcopAlux, construido en nuestro laboratorio previamente por Ivask et al.34), Enterococcus faecalis ATCC 29,212 (obtenido del West-Tallinn Central Hospital) y Staphylococcus aureus ATCC 25,923 (obtenido del West-Tallinn Central Hospital) se almacenaron en agarizado Luria –Medio Bertani (LB, 1% triptona, 0,5% extracto de levadura, 0,5% NaCl, 1,5% agar) y antes de las pruebas cultivadas en 3 mL de RPMI a 37 °C con agitación a 200 rpm durante la noche. Después del cultivo durante la noche, se mezclaron 400 µl de inóculo con 20 ml de RPMI CCM y se incubaron durante 4 hy se desarrollaron hasta la fase exponencial. Después de la incubación, se midió la densidad óptica de la suspensión bacteriana a 620 nm (DO620) y se preparó la suspensión a la DO620 deseada. En el caso de bacterias recombinantes, RPMI CCM se complementó con 100 µg/l de ampicilina y 10 µg/l de tetraciclina para retener el plásmido que codifica la bioluminiscencia.

La MBC se determinó por la concentración más baja que mata al 99,9% de la población bacteriana inicial utilizando la prueba de mancha descrita por Suppi et al.42. Después de un cultivo nocturno y una incubación de 4 h hasta la fase exponencial, como se describió anteriormente, se obtuvo la suspensión bacteriana con OD620 0.07 (corresponde a 2 × 108 células/mL43) en MQ, RPMI CCM o LB. Se añadieron 100 μL de suspensión bacteriana a 100 μL de componentes solos o su mezcla en el medio. Las bacterias se expusieron en RPMI CCM, LB o MQ en microplacas de 96 pocillos (BD Falcon) a 30 °C durante 24 h sin agitación en la oscuridad. Se pipetearon 3 µl de suspensión incubada sobre medio LB agarizado y se evaluó visualmente la viabilidad de las células bacterianas (formación de colonias) después de 24 h de incubación. Cada experimento fue repetido al menos tres veces.

Las bacterias se prepararon para la prueba como se describe en el párrafo "Evaluación de la concentración mínima bactericida (MBC)". La suspensión bacteriana con OD620 0,03 en MQ, RPMI CCM o LB se incubó durante 3 ha 37 °C en un agitador y se midió la densidad bacteriana a OD620.

La permeabilización de la pared celular de E. coli y P. aeruginosa por AgNO3, cAg, CuO, CuO–COOH, CuO–NH2, CuSO4 y Polimixina B (PB, control positivo) se analizó mediante la absorción celular de N-Phenylnaphthalen-1- amina (1-NPN) esencialmente como se describe por Helander y Mattila-Sandholm44. A diferencia de un entorno hidrofílico, la fluorescencia de 1-NPN aumenta significativamente en un entorno hidrofóbico (p. ej., bicapa lipídica de membrana), lo que lo convierte en un tinte apropiado para sondear la integridad de la membrana externa (OM) de bacterias gramnegativas. Brevemente, 50 µL de 1-NPN 40 µM y 50 µL del compuesto probado en ácido 3-(N-morfolino)propanosulfónico (MOPS) 50 mM ajustado con base de tris(hidroximetil)aminometano (TRIS) a pH 7,2 (MOPS-TRIS) tampón) se pipetearon en los pocillos de microplacas negras. Se dispensaron 100 µL de suspensión bacteriana en tampón MOPS-TRIS 50 mM con OD = 0,5 en cada pocillo y se midió la fluorescencia después de 30 min de incubación a temperatura ambiente (luminómetro de placa Fluoroskan Ascent FL; filtros de excitación/emisión 350/460 nm). Se calculó el factor de captación de células 1-NPN y se presentó como una relación entre la intensidad de los valores de fluorescencia de la suspensión bacteriana incubada con y sin compuestos de ensayo. Se realizaron al menos tres experimentos independientes en duplicados técnicos.

La inducción de luminiscencia en bacterias por iones intracelulares de Ag y Cu se realizó utilizando bacterias biosensoras recombinantes Escherichia coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux). La respuesta de E. coli recombinante a los iones Ag y Cu intracelulares está mediada por la proteína activadora CueR y su promotor copA regulado que se fusiona con los genes que codifican la bioluminiscencia34. Por lo tanto, en la región subtóxica, la presencia de iones Ag y Cu intracelulares conduce al aumento de la bioluminiscencia de estas bacterias recombinantes de manera dependiente de la dosis.

La preparación de las bacterias de prueba y el procedimiento del ensayo del biosensor fueron análogos al ensayo de inhibición del crecimiento bacteriano con una excepción: el medio de crecimiento del biosensor Ag bioluminiscente E. coli MC1061 (pSLcueR/pDNPcopAlux) se complementó con 100 µg/l de ampicilina y 10 µg/l de tetraciclina durante el cultivo durante la noche para mantener los plásmidos recombinantes. Se utilizó un luminómetro de placa Orion II (Berthold Detection Systems) para la medición de bioluminiscencia (BL). Se expusieron 100 µl de suspensión bacteriana con OD620 0,1 a los componentes o su mezcla en RPMI CCM (muestra) o RPMI CCM (fondo) a 30 °C durante 4 h. Las curvas de dosis-respuesta del biosensor de Ag y Cu se obtuvieron trazando las concentraciones aplicadas de Cu y Ag frente a la bioluminiscencia del biosensor de Ag/Cu (como inducción de pliegues) en muestras respectivas. La concentración con el valor de bioluminiscencia más alto de cada componente se ha marcado como el pico de LC. La inducción de pliegues se calculó de la siguiente manera:

donde BLsample es la bioluminiscencia del biosensor Ag/Cu en la muestra y BLbackground es la bioluminiscencia de fondo considerando el oscurecimiento de la luminiscencia debido a las NP.

Dado que la presencia de células puede influir en la generación y neutralización de ROS, las ROS se cuantificaron tanto en condiciones bióticas (en presencia de células) como abióticas (sin células).

Para estudiar la producción celular (biótica) de ROS, se disolvió stock fresco de diacetato de 2′,7′-diclorodihidrofluoresceína (H2DCFDA) en etanol a una concentración de 0,6 mg/mL y luego se diluyó en tampón de fosfato de sodio 0,1 M. Se pipetearon 100 µl de componente en agua MQ en los pocillos. Luego, se agregaron 100 µL de cultivo bacteriano (E. coli K-12 a OD620 = 0.1) en agua MQ. Las placas de ensayo se incubaron a 30 °C durante 4 h. Después de la incubación, se dividieron en alícuotas de 100 μl de la mezcla en placas negras no transparentes de 96 pocillos y se añadió H2DCFDA a las células a una concentración final de 1,5 μg/ml. Después de 30 min de incubación, se midió la fluorescencia utilizando un lector de microplacas (excitación/emisión a 485/527 nm). En el ensayo, H2DCFDA se difunde a través de la membrana celular y es procesado por esterasas intracelulares a una diclorofluorescina no fluorescente (DCFH). Luego, DCFH se convierte en 2',7'-diclorofluoresceína (DCF) altamente fluorescente debido a la presencia de ROS intracelular.

Para estudiar ROS en condiciones abióticas, el grupo acetato de H2DCFDA se escindió con NaOH 0,01 M a TA durante 30 min. El colorante se diluyó con tampón de fosfato de sodio 0,1 M hasta una concentración de 24 µg/ml y luego se añadió a cada pocillo de las placas negras no transparentes de 96 pocillos, para producir una concentración de colorante final de 12 µg/ml. Los resultados se dividieron por el blanco y se presentaron como unidades relativas de luz (RFU).

Para el análisis de disolución, se incubaron 100 mg/l de cAg, Ag2O, nAg, AgNO3, CuSO4 (un control de recuperación) en agua MQ o en RPMI CCM a 37 °C durante 24 h y luego se centrifugaron a 320 000 × g durante 30 min ( ultracentrífuga Beckman Coulter). Después de la centrifugación, se recogieron los sobrenadantes y se analizó la concentración de plata mediante AAS (contrAA 800, Analytik Jena Ag). El porcentaje de disolución de NP se calculó según la concentración de plata en el sobrenadante después de la centrifugación, se tomó 100 mg/l como 100%. Las mediciones se realizaron por triplicado en al menos dos experimentos independientes.

La detección de Cu+ se realizó por el método yodométrico45. El Cu2+ estaba enmascarado por una formación de complejo con oxalato de potasio; luego, el Cu+ fue oxidado a Cu2+ por yodato de potasio en presencia de ácido clorhídrico 2 M usando la solución de almidón al 1% como indicador de la presencia de yodo, el cual aparece cuando se completa la reacción.

Los valores de p utilizando la prueba t de Student, las desviaciones estándar y los valores medios se calcularon en Microsoft Excel.

Los datos utilizados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente a pedido razonable.

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Agradecemos al Dr. Villem Aruoja (Instituto Nacional de Física Química y Biofísica, Estonia) por las correcciones en inglés del manuscrito.

EIC Accelerator Grant No. 190199469 (NANOWOUND) de la Comisión Europea (Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Olesja Bondarenko). Beca GOVSG16 del Consejo de Investigación de Estonia (Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Olesja Bondarenko). Arengufond_OB Beca del Fondo de Desarrollo del Instituto Nacional de Física Química y Biofísica (Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Olesja Bondarenko). Beca PRG749 del Consejo de Investigación de Estonia (Anne Kahru). Beca COVSG5 de la Agencia de Investigación de Estonia (Denys Bondar, Yevgen Karpichev). El estudio fue apoyado parcialmente por el Proyecto del Fondo Europeo de Desarrollo Regional "Órdenes emergentes en nanomateriales y cuánticos" (TK134).

Laboratorio de Toxicología Ambiental, Instituto Nacional de Física Química y Biofísica, Akadeemia tee 23, 12618, Tallin, Estonia

Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo, Heiki Vija, Anne Kahru y Olesja Bondarenko

Nanordica Medical OÜ, Vana-Lõuna tn 39a-7, 10134, Tallin, Harjumaa, Estonia

Grigory Vasiliev, Anna-Liisa Kubo y Olesya Bondarenko

Departamento de Química y Biotecnología, Universidad Tecnológica de Tallin, Akadeemia tee 15, 12618, Tallin, Estonia

Grigory Vasiliev, Denys Bondar y Yevgen Karpichev

Academia de Ciencias de Estonia, Kohtu 6, 10130, Tallin, Estonia

Madre Kahru

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Conceptualización, GV, OB; Curaduría de datos, GV y A.-LK; Análisis formal, GV; Investigación, GV, A.-LK y OB; Metodología, GV, A.-LK, OB, HV y DB; Administración de proyectos, OB, AK, YK; Recursos, AK, YK y OB; Validación, OB; Visualización, VG; Redacción de borrador, GV y OB; Revisión del manuscrito, GV, A.-LK, OB, HV, DB, YK, AK Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito.

Correspondencia a Olesja Bondarenko.

A.-LK, GV, OB son cofundadores de Nanordica Medical que desarrollan productos antibacterianos basados ​​en nanopartículas. AK, DB, HV y YK declaran no tener intereses contrapuestos.

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Reimpresiones y permisos

Vasiliev, G., Kubo, AL., Vija, H. et al. Efecto antibacteriano sinérgico de las nanopartículas de cobre y plata y su mecanismo de acción. Informe científico 13, 9202 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36460-2

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Recibido: 27 enero 2023

Aceptado: 04 junio 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36460-2

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